वैद्युतकणसंचलन के लिए एगरोज़ जेल तैयार करना

वैद्युतकणसंचलन के लिए अगारोज जेल की तैयारी

नोट: हमेशा डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें!

चरण-दर-चरण निर्देश

वजन Agarose पाउडर:u0.3 ग्राम एगेरोज़ पाउडर (30 मि.ली. प्रणाली पर आधारित) को मापने के लिए तौलने वाले कागज और एक इलेक्ट्रॉनिक तराजू का उपयोग करें।

टीबीएसटी बफर तैयार करना:p100 मिलीलीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में 1x टीबीएसटी बफर के 30 मिलीलीटर को दोबारा तैयार करें।

अगारोज पाउडर को घोलना:pएगरोज़ पाउडर को टीबीएसटी बफर में डालें और अच्छी तरह हिलाएं।उन्हें अंदर डालोपूरी तरह से घुलने तक माइक्रोवेव में रखें और गर्म करें (आमतौर पर 50 सेकंड के लिए, एल्युमीनियम फॉयल से ढककर)।

ठंडा करना और न्यूक्लिज़ जोड़ना:uमिश्रण को माइक्रोवेव से निकालने के लिए दस्ताने पहनें और इसे गर्म (लगभग 60°C) होने तक ठंडे पानी में थोड़ा ठंडा होने दें। अच्छी तरह मिलाने के लिए हिलाते समय 2μl न्यूक्लीज़ (ईबी विकल्प) मिलाएं।

जेल मोल्ड तैयार करना:

• Cदुबला और सूखाजेल ट्रे और जेल कास्टिंग डिवाइसवैद्युतकणसंचलन टैंक का.
•  Pजेल का फीता लगाएंट्रेआंतरिक टैंक में और कंघी को एक निश्चित स्थान पर डालें।
• लगभग 65°C तक ठंडा किया हुआ अगारोज जेल घोल मिलाएं और ध्यान से इसे डालेंजेल ट्रेमेंजेल कास्टिंग डिवाइस, इसे धीरे-धीरे फैलाएं जब तक कि यह कांच की प्लेट पर एक समान जेल परत न बना ले।
• इसे कमरे के तापमान पर तब तक रहने दें जब तक कि जेल पूरी तरह से जम न जाए।
• धीरे से कंघी को लंबवत हटा दें और टेप हटा दें।
• जेल लगाएंट्रेवैद्युतकणसंचलन टैंक में.

महत्वपूर्ण: सुनिश्चित करें कि कंघी के दांत वाले क्षेत्र में कोई हवा के बुलबुले न हों। तरल की सतह बिना लहर के चिकनी होनी चाहिए।

जेल चलाना

जेल लोड हो रहा है

जेल के जमने के बाद, इसे वैद्युतकणसंचलन टैंक में रखें और वैद्युतकणसंचलन बफर को तब तक डालें जब तक कि जेल डूब न जाए।

नमूने तैयार करना

• रेफ्रिजरेटर से मार्कर और लोडिंग बफर लें।
• नमूनों में 6μl लोडिंग बफर जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
• एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, नमूनों को धीरे-धीरे जेल के बड़े कुओं में लोड करें (सावधान रहें कि जेल में छेद न हो और हवा के बुलबुले से बचने के लिए पूरी मात्रा को वितरित न करें)।
• मार्कर को किसी भी छोटे कुएं में लोड करें (उसकी स्थिति याद रखें)।

वैद्युतकणसंचलन प्रारंभ करना

• इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक को ढक दें और जेल लोड करने के तुरंत बाद इलेक्ट्रोफोरेसिस शुरू करें।
• वोल्टेज को 60-100V पर सेट करें। नमूने नकारात्मक इलेक्ट्रोड (काले) से सकारात्मक इलेक्ट्रोड (लाल) की ओर स्थानांतरित हो जाएंगे।
• उच्च वोल्टेज एगरोज़ जेल की प्रभावी पृथक्करण सीमा को छोटा कर देता है।
• जब ब्रोमोफेनॉल नीली डाई जेल प्लेट के निचले किनारे से लगभग 1 सेमी तक पहुंच जाए तो वैद्युतकणसंचलन बंद कर दें।

परिणामों का अवलोकन

बैंड को अलग करने के बाद, वैद्युतकणसंचलन बंद करें, जेल निकालें, और सीधे इसका पता लगाएं और तस्वीर लें।

बैंड की तस्वीर लेने और निरीक्षण करने के लिए जेल इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करें (जांचें कि मार्कर या नमूनों के लिए कोई बैंड हैं या नहीं)।

अपना जेल बैंड मानचित्र प्राप्त करने के बाद, मार्कर ढूंढें। मार्कर के आधार पर, आप लक्ष्य बैंड निर्धारित कर सकते हैं!

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