हीमोग्लोबिन वैद्युतकणसंचलन प्रयोग

प्रयोग सिद्धांत

हीमोग्लोबिन वैद्युतकणसंचलन का उद्देश्य विभिन्न सामान्य और असामान्य हीमोग्लोबिन का पता लगाना और पुष्टि करना है।

एक निश्चित पीएच बफर समाधान में, विभिन्न हीमोग्लोबिन प्रकार के विभिन्न चार्ज और आइसोइलेक्ट्रिक बिंदुओं के कारण, जब हीमोग्लोबिन का आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु बफर समाधान के पीएच से कम होता है, तो हीमोग्लोबिन एक नकारात्मक चार्ज रखता है और इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान एनोड की ओर स्थानांतरित हो जाता है। इसके विपरीत, सकारात्मक चार्ज वाला हीमोग्लोबिन कैथोड की ओर बढ़ता है।

एक निश्चित वोल्टेज के तहत और एक विशिष्ट वैद्युतकणसंचलन समय के बाद, विभिन्न आवेशों और आणविक भार वाले हीमोग्लोबिन अलग-अलग प्रवासन दिशा और गति प्रदर्शित करते हैं। यह अलग-अलग क्षेत्रों को अलग करने की अनुमति देता है, और विभिन्न हीमोग्लोबिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए इन क्षेत्रों पर बाद में वर्णमिति या इलेक्ट्रोफोरेटिक स्कैनिंग विश्लेषण किया जा सकता है। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि पीएच 8.6 सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली वैद्युतकणसंचलन है।

साइटोप्लाज्म के भीतर, ग्लाइकोजन या पॉलीसेकेराइड पदार्थों (जैसे म्यूकोपॉलीसेकेराइड, म्यूकोप्रोटीन, ग्लाइकोप्रोटीन, ग्लाइकोलिपिड्स, आदि) में मौजूद एथिलीन ग्लाइकॉल समूह (सीएचओएच-सीएचओएच) आवधिक एसिड द्वारा ऑक्सीकृत होते हैं और एल्डिहाइड समूहों (सीएचओ-सीएचओ) में परिवर्तित हो जाते हैं। ये एल्डिहाइड समूह रंगहीन बैंगनी-लाल शिफ़ अभिकर्मक के साथ मिलकर एक बैंगनी-लाल रंग बनाते हैं जो कोशिका में पॉलीसेकेराइड मौजूद होने पर जमा हो जाता है। इस प्रतिक्रिया को आवधिक एसिड-शिफ (पीएएस) धुंधलापन के रूप में जाना जाता है, जिसे पहले ग्लाइकोजन धुंधलापन कहा जाता था।

प्रयोग विधि

सामग्री:सेलूलोज एसीटेटमेमब्रैन, वैद्युतकणसंचलन उपकरण(DYCP-38C और बिजली आपूर्ति DYY-6C), सुपीरियर सैंपल लोडिंग टूल(विंदुक), स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, कलरिमेट्रिक क्यूवेट्स, बफ़र्स।

बफ़र:

(1) पीएच 8.6 टीईबी बफर: 10.29 ग्राम ट्रिस, 0.6 ग्राम ईडीटीए, 3.2 ग्राम बोरिक एसिड का वजन करें और 1000 मिलीलीटर में आसुत जल मिलाएं।

(2) बोरेट बफर: 6.87 ग्राम बोरेक्स और 5.56 ग्राम बोरिक एसिड का वजन करें, और 1000 मिलीलीटर में आसुत जल मिलाएं।

प्रक्रिया:

Pहीमोग्लोबिन समाधान की मरम्मत

थक्कारोधी के रूप में हेपरिन या सोडियम साइट्रेट युक्त 3 मिलीलीटर रक्त लें। 10 मिनट के लिए 2000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें और प्लाज्मा को हटा दें। लाल रक्त कोशिकाओं को फिजियोलॉजिकल सलाइन (750 आरपीएम, हर बार 5 मिनट सेंट्रीफ्यूजेशन) से तीन बार धोएं। 10 मिनट के लिए 2200 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। समान मात्रा में आसुत जल मिलाएं, फिर 0.5 गुना मात्रा में कार्बन टेट्राक्लोराइड मिलाएं। 5 मिनट के लिए जोर से हिलाएं, और फिर बाद में उपयोग के लिए ऊपरी एचबी समाधान इकट्ठा करने के लिए 10 मिनट के लिए 2200 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें।

झिल्ली को भिगोना

सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली को 3 सेमी × 8 सेमी मापने वाली पट्टियों में काटें। उन्हें पूरी तरह से संतृप्त होने तक पीएच 8.6 टीईबी बफर में भिगोएँ, फिर हटा दें और फिल्टर पेपर से सुखा लें।

खोलना

हीमोग्लोबिन घोल के 10 μl को सेल्युलोज एसीटेट झिल्ली (खुरदरी तरफ) पर किनारे से लगभग 1.5 सेमी की दूरी पर रखने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।

वैद्युतकणसंचलन

बोरेट बफर समाधान को वैद्युतकणसंचलन कक्ष में डालें। सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली को कक्ष के कैथोड सिरे पर धब्बेदार भाग के साथ रखें। 30 मिनट के लिए 200 वी पर चलाएं।

क्षालन

एचबीए और एचबीए2 ज़ोन को काटें, उन्हें अलग-अलग टेस्ट ट्यूब में रखें और क्रमशः 15 मिली और 3 मिली आसुत जल डालें। हीमोग्लोबिन को पूरी तरह से ख़त्म करने के लिए धीरे से हिलाएँ, फिर मिलाएँ.

वर्णमिति

निक्षालन समाधान के लिए आसुत जल का उपयोग करके अवशोषण को शून्य करें और 415 एनएम पर अवशोषण को मापें।

गणना

HbA2(%) = HbA2 ट्यूब का अवशोषण / (HbA ट्यूब का अवशोषण × 5 + HbA2 ट्यूब का अवशोषण) × 100%

प्रायोगिक परिणाम गणना

पीएच 8.6 टीईबी बफर सेल्युलोज एसीटेट इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए संदर्भ रेंज: एचबीए > 95%, एचबीए2 1%-3.1%

टिप्पणियाँ

वैद्युतकणसंचलन का समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए। इलेक्ट्रोफोरेसिस के दौरान सेल्युलोज एसीटेट झिल्ली सूखनी नहीं चाहिए। जब HbA और HbA2 स्पष्ट रूप से अलग हो जाएं तो वैद्युतकणसंचलन बंद कर दें। लंबे समय तक वैद्युतकणसंचलन बैंड प्रसार और धुंधलापन का कारण बन सकता है।

बहुत अधिक नमूने का उपयोग करने से बचें. अत्यधिक हीमोग्लोबिन तरल से बैंड डिटेचमेंट या अपर्याप्त धुंधलापन हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एचबीए का स्तर गलत तरीके से बढ़ सकता है।

प्रोटीन के साथ सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली के संदूषण को रोकें।

धारा बहुत अधिक नहीं होनी चाहिए; अन्यथा, हीमोग्लोबिन बैंड अलग नहीं हो सकते।

नियंत्रण के रूप में हमेशा सामान्य व्यक्तियों और आवश्यक ज्ञात असामान्य हीमोग्लोबिन के नमूने शामिल करें।

बीजिंग लियूई बायोटेक्नोलॉजी हीमोग्लोबिन इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए पेशेवर इलेक्ट्रोफोरेसिस टैंक का निर्माण करती है जो कि मॉडल हैडीवाईसीपी-38सीसेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली वैद्युतकणसंचलन टैंक, और सेलूलोज़ एसीटेट झिल्ली वैद्युतकणसंचलन टैंक के लिए वैद्युतकणसंचलन बिजली आपूर्ति के दो मॉडल उपलब्ध हैंDYY-2CऔरDYY-6Cबिजली की आपूर्ति।

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