नमूना तैयार करना औरलोड हो रहा है
ज्यादातर मामलों में जेल को स्टैक किए बिना निरंतर बफर सिस्टम के उपयोग के कारण, नमूनों में उचित एकाग्रता और छोटी मात्रा होनी चाहिए। का उपयोग करोविंदुकरिज़ॉल्यूशन में महत्वपूर्ण कमी से बचने के लिए, प्रति कुएं 5-10 μg के साथ धीरे-धीरे नमूना जोड़ें। कबनमूना लोड हो रहा है, बिजली की आपूर्ति बंद होनी चाहिए। नमूने में घनत्व बढ़ाने, नमूने को केंद्रित करने और प्रसार को रोकने के लिए एक संकेतक डाई (0.025% ब्रोमोफेनॉल नीला या नारंगी) और सुक्रोज (10-15%) या ग्लिसरॉल (5-10%) होना चाहिए। हालांकि, कभी-कभी सुक्रोज या ग्लिसरॉल इलेक्ट्रोफोरेसिस परिणामों में यू-आकार के बैंड का कारण बन सकता है, जिसे 2.5% फिकोल (पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन) का उपयोग करके टाला जा सकता है।
वैद्युतकणसंचलन
वैद्युतकणसंचलन के लिए वोल्टेज 5-15 वी/सेमी है, आमतौर पर लगभग 10 वी/सेमी। बड़े अणुओं को अलग करने के लिए, वोल्टेज कम होना चाहिए, आमतौर पर 5 वी/सेमी से अधिक नहीं।
धुंधलापन
फ्लोरोसेंट डाई एथिडियम ब्रोमाइड (ईबी) का उपयोग आमतौर पर एगरोज़ जेल में डीएनए बैंड का निरीक्षण करने के लिए धुंधलापन के लिए किया जाता है। ईबी डीएनए अणुओं के आधार जोड़े के बीच सम्मिलित हो सकता है, जिससे ईबी डीएनए से बंध जाता है। डीएनए द्वारा 260 एनएम पराबैंगनी प्रकाश का अवशोषण ईबी में स्थानांतरित किया जाता है, और बाध्य ईबी दृश्य प्रकाश स्पेक्ट्रम के लाल-नारंगी क्षेत्र में 590 एनएम पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करता है। जेल को 1 mmol/L MgSO4 घोल में 1 घंटे के लिए स्टेन करने से अनबाउंड EB के कारण होने वाली पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम किया जा सकता है, जिससे डीएनए की छोटी मात्रा का पता लगाने में सुविधा होती है।
ईबी डाई के कई फायदे हैं: इसका उपयोग करना आसान है, यह न्यूक्लिक एसिड को नहीं तोड़ता है, इसमें उच्च संवेदनशीलता है, और डीएनए और आरएनए दोनों को दाग सकता है। ईबी को नमूने में जोड़ा जा सकता है और किसी भी समय यूवी अवशोषण का उपयोग करके ट्रैक किया जा सकता है। धुंधला होने के बाद, ईबी को एन-ब्यूटेनॉल के साथ निष्कर्षण द्वारा हटाया जा सकता है।
हालाँकि, ईबी डाई एक शक्तिशाली उत्परिवर्तजन है, और इसे संभालने के दौरान पॉलीथीन दस्ताने पहनने जैसी सावधानियां बरतनी चाहिए। एक्रिडीन ऑरेंज भी आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली डाई है क्योंकि यह सिंगल-स्ट्रैंडेड और डबल-स्ट्रैंडेड न्यूक्लिक एसिड (डीएनए, आरएनए) के बीच अंतर कर सकती है। यह डबल-स्ट्रैंडेड न्यूक्लिक एसिड के लिए हरी प्रतिदीप्ति (530 एनएम) और एकल-स्ट्रैंडेड न्यूक्लिक एसिड के लिए लाल प्रतिदीप्ति (640 एनएम) प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, अन्य रंगों जैसे मेथिलीन ब्लू, मेथिलीन ग्रीन और क्विनोलिन बी का उपयोग धुंधलापन के लिए किया जा सकता है।
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पोस्ट करने का समय: दिसंबर-20-2023